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O sistema CRISPR-Cas9 utiliza uma molécula de RNA-guia para...
O sistema CRISPR-Cas9 utiliza uma molécula de RNA-guia para direcionar a enzima Cas9 até uma região do DNA. O reconhecimento depende do pareamento entre bases do RNA e da sequência-alvo, além da presença de uma sequência adjacente denominada PAM. Depois da clivagem, os mecanismos celulares de reparo atuam sobre o DNA e podem produzir a modificação genética pretendida.
DOUDNA, Jennifer A.; CHARPENTIER, Emmanuelle. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9. Science, v. 346, n. 6213, art. 1258096, 2014. DOI: 10.1126/science.1258096. Adaptado.
Em um experimento de edição gênica, pesquisadores utilizaram dois RNAs-guia direcionados à mesma região:
• o RNA-guia I apresentava complementaridade elevada com a sequência-alvo;
• o RNA-guia II possuía alterações em alguns nucleotídeos, mas conservava correspondência parcial com a sequência-alvo.
Após o tratamento, o sequenciamento revelou que ambos produziram modificações na região pretendida. Entretanto, nas células tratadas com o RNA-guia II, também foram encontradas alterações em outra região do genoma com sequência parcialmente semelhante ao alvo.
O resultado obtido com o RNA-guia II evidencia que
A
as alterações no RNA-guia ampliaram a atividade catalítica da Cas9, permitindo que a enzima realizasse cortes em qualquer sequência acompanhada de uma região PAM.
B
a complementaridade parcial possibilitou o reconhecimento de uma região semelhante à sequência-alvo, reduzindo a especificidade e produzindo uma modificação fora do alvo.
C
as alterações no RNA-guia impediram sua associação com a Cas9, de modo que as modificações observadas foram produzidas exclusivamente pelos mecanismos espontâneos de reparo.
D
a presença de uma sequência parcialmente semelhante levou a Cas9 a substituir diretamente os nucleotídeos dessa região, sem participação dos mecanismos celulares de reparo.
E
o RNA-guia II passou a atuar sobre moléculas de RNA mensageiro produzidas pelas duas regiões, modificando a tradução sem provocar alterações no DNA.