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Na etapa anterior ao ciclo do ácido cítrico ocorre a oxidação do piruvato a acetil-CoA. Por ser uma molécula muito carregada, o piruvato, em células eucariontes, entra na mitocôndria por processo ativo com a ajuda de proteína de transporte. Posteriormente, um complexo de diversas enzimas (o complexo piruvato-desidrogenase) catalisa três reações. A coenzima A (CoA) composto, contendo:
Enxofre derivado da vitamina B: é anexada ao acetato por uma ligação do enxofre ao acetato, formando acetil-CoA com alto potencial energético.
Hidrogênio derivado do NADH: é anexada ao acetato por uma ligação do hidrogênio ao acetato, formando acetil-CoA com alto potencial energético.
Carbono, derivado do grupo carboxila do piruvato: é anexada ao acetato por uma ligação do carbono ao acetato, formando acetil-CoA com alto potencial energético.
Oxigênio derivado do CO2 liberado do grupo carboxila do piruvato: é anexada ao acetato por uma ligação do oxigênio ao acetato, formando acetil-CoA, com alto potencial energético.