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Durante a etapa de anelamento na PCR, a temperatura deve ser cuidadosamente ajustada para garantir a especificidade da reação. A utilização de uma temperatura de anelamento abaixo da ideal resulta, principalmente, em:
Redução da atividade da DNA polimerase termoestável.
Aumento da especificidade do pareamento dos primers.
Formação de produtos inespecíficos devido ao pareamento inadequado dos primers.
Inibição completa da síntese de DNA.